一种聚合物微球及其制备方法和应用与流程-开云(中国)Kaiyun·官方网站 -APP下载

文档序号:34131600发布日期:2023-11-28阅读:298来源:国知局


1.本发明属于高分子材料和生物医学技术领域,种聚制备涉及一种聚合物微球及其制备方法和应用。合物和


背景技术:

2.以聚乳酸等可降解聚合物为主要原料制备的微球可降解聚合物微球(粒径从纳米到微米级的球形或其它几何形状的材料),由于具有优良的用流生物相容性、可降解性、种聚制备性能可调、合物和控释性、微球降解产物对人体高度安全并可被组织吸收等诸多优势,用流被广泛应用于皮肤填充、种聚制备组织修复、合物和眼科治疗、微球肿瘤治疗、用流免疫学或临床诊断等生物医学领域中,种聚制备具有重要的合物和应用价值。
3.乳化-固化法(如乳液溶剂挥发法、微球膜乳化法)是一类常用的可降解聚合物微球制备方法。该方法的制备过程一般如下:首先通过乳化的方法制备成聚合物的水包油(o/w)或水包油包水(w/o/w)等类型乳液,然后去除聚合物的溶剂,最终得到可降解聚合物微球。该方法常用的乳化剂有聚乙烯醇、聚山梨酯tween80、聚山梨酯tween20、十二烷基磺酸钠等。虽然乳化剂的用量不多,但由于不易降解并且具有潜在的安全隐患,如果使用不当会对人的健康造成很大影响。因此,需要对乳化剂的安全使用限量做出规定,并且在微球产品制备后增加乳化剂清洗环节,使生产制备工艺复杂化。低毒性是可降解聚合物微球的一个硬性指标,因此寻找安全的乳化剂至关重要。


技术实现要素:

4.为解决上述技术问题,本发明提供一种聚合物微球及其制备方法和应用。
5.本发明的技术方案如下:
6.一种聚合物微球的制备方法,所述制备方法选自乳化-固化法,所述乳化-固化法中采用的乳化剂选自低聚乳酸。
7.根据本发明的实施方案,所述制备方法具体包括以下步骤:
8.1)将聚合物与有机溶剂混合得到含聚合物的溶液;
9.2)将步骤1)中含聚合物的溶液分散至含有乳化剂的水相溶液中,经过乳化得到乳液;其中,乳化剂选自低聚乳酸;
10.3)去除步骤2)的乳液中的有机溶剂,得到所述聚合物微球。
11.根据本发明的实施方案,步骤1)中,所述含聚合物的溶液中还含有功能性物质;具体的,所述功能性物质可以与所述聚合物一起加入,也可以分开加入。
12.根据本发明的实施方案,所述功能性物质选自生物活性因子、药物、无机盐中的至少一种。
13.具体的,所述生物活性因子可选自本领域已知的物质,例如选自维生素c乳酸酯(例如中国专利文献cn115350110a)、多肽(如成纤维生长因子、表皮生长因子)或胶原。
14.还具体的,所述药物可选自本领域已知的物质,例如选自肉毒素。
15.还具体的,所述无机盐可选自本领域已知的物质,例如选自碳酸氢铵(nh4hco3)或
氢氧化钠(naoh)。
16.根据本发明的实施方案,所述功能性物质可以直接加入或者可以通过含有所述功能性物质的水溶液形式加入。
17.根据本发明的实施方案,所述功能性物质与聚合物的质量比为(0~5):1,例如为1:1、2:1、3:1、4:1。
18.根据本发明的实施方案,步骤1)中,所述聚合物与有机溶剂混合,可以是溶解,也可以是乳化处理。具体的,可以是将聚合物溶于有机溶剂,得到含聚合物的溶液;也可以是将聚合物和功能性物质加入有机溶剂中,经乳化得到含聚合物的溶液。
19.根据本发明的实施方案,步骤1)中,所述乳化处理可以是在1000~15000rpm/min,更优选的是在4000~8000rpm/min(具体6000rpm/min)下乳化处理1秒~90秒(具体例如5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒)。
20.根据本发明的实施方案,步骤1)中,所述聚合物选自可降解聚合物。
21.根据本发明的实施方案,所述可降解聚合物选自聚乳酸(pla)(例如可以是聚左旋乳酸(plla)、聚右旋乳酸(pdla)或消旋聚乳酸(pdlla))、聚羟基乙酸(pga)、聚己内酯(pcl)、聚对二氧环己酮(ppdo)的均聚物或共聚物(例如可以是己内酯-丙交酯共聚物(pcla)、乙交酯丙交酯共聚物(plga)、对二氧环己酮乳酸共聚物p(la-pdo)等)中的至少一种。
22.根据本发明的实施方案,所述聚合物的分子量为2000g/mol~200000g/mol,优选为5000g/mol~150000g/mol,更优选为10000g/mol~100000g/mol,例如为2000g/mol、5000g/mol、10000g/mol、20000g/mol、50000g/mol、75000g/mol、100000g/mol、150000g/mol。
23.根据本发明的实施方案,步骤1)中,所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、三氟乙酸、六氟异丙醇中的至少一种。
24.根据本发明的实施方案,步骤2)中,所述低聚乳酸的分子式为其中n为2~15中的任一数字。
25.根据本发明的实施方案,步骤2)中,所述低聚乳酸的分子量为162g/mol~1098g/mol,优选为162g/mol~954g/mol,例如为162g/mol、234g/mol、306g/mol、378g/mol、450g/mol、522g/mol、594g/mol、666g/mol、738g/mol、810g/mol、882g/mol、954g/mol、1026g/mol或1098g/mol。
26.根据本发明的实施方案,步骤2)中,所述水相溶液包括乳化剂和水。优选地,所述水相溶液中,乳化剂的浓度为0.01mg/ml~600mg/ml;优选为0.1mg/ml~300mg/ml;更优选为10mg/ml~60mg/ml;例如为0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、20mg/ml、22mg/ml、24mg/ml、26mg/ml、28mg/ml、30mg/ml、32mg/ml、34mg/ml、36mg/ml、38mg/ml、40mg/ml、42mg/ml、44mg/ml、46mg/ml、48mg/ml、50mg/ml、52mg/ml、54mg/ml、56mg/ml、60mg/ml或上述点值两两组合后的范围内的任一点值。
27.根据本发明的实施方案,步骤2)中,所述乳化剂和聚合物的质量比为(50~5000):100;还可以为(110~3000):100;再具体的可以为(120~2000):100;例如为60:100、70:100、80:100、90:100、100:100、110:100、150:100、200:100、300:100、400:100、500:100、600:100、700:100、800:100、900:100、1000:100、1100:100、1200:100、1800:100、2000:100、3000:100、4000:100或5000:100。
28.根据本发明的实施方案,步骤2)中,所述乳化选自搅拌、高速剪切乳化、超声乳化、膜乳化中的至少一种。
29.根据本发明的实施方案,步骤2)中,所述乳化可以是在200~15000rpm/min,例如在1000rpm/min、2000rpm/min、3000rpm/min、4000rpm/min、6000rpm/min或8000rpm/min下乳化1秒~360分钟,优选为1秒~60分钟,更优选为1秒~10分钟(具体例如5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟)。
30.根据本发明的实施方案,步骤3)中,去除乳液中的有机溶剂是指通过加热、抽真空、旋转蒸发、扩散或挥发中的至少一种方式去除有机溶剂。优选地,加热时,加热温度为25~50℃。
31.根据本发明的实施方案,步骤2)和步骤3)具体包括:将步骤1)中含聚合物的溶液倒入含有乳化剂的水相溶液中,一定转速下(如1000~15000rpm/min)乳化一定时间(如1秒~10分钟)后倒入水中,一定转速下(如200~15000rpm/min)继续搅拌一定时间(如2小时~10小时)、待有机溶剂挥发后,得到所述聚合物微球。
32.根据本发明的实施方案,步骤2)和步骤3)具体也可以包括:将步骤1)中含聚合物的溶液分散在含有乳化剂的水相溶液中得到初乳液,将该初乳液倒入膜乳化机中反复压过一定孔径(例如30μm)的微孔膜得到均匀乳液,然后倒入一定浓度(例如为1%)的nacl水溶液中进行液滴固化,得到所述聚合物微球。
33.根据本发明的实施方案,步骤2)和步骤3)具体也可以包括:将步骤1)中含聚合物的溶液滴入含有乳化剂的水相溶液中,以一定转速(具体如500~1200rpm/min搅拌混合一定时间(如5小时~20小时)、待有机溶剂去除后,得到所述聚合物微球。
34.本发明还提供通过上述制备方法得到的聚合物微球。
35.根据本发明的实施方案,所述聚合物微球的平均粒径为0.1μm~300μm,优选为1μm~200μm,更优选为5μm~100μm。
36.本发明还提供上述聚合物微球的用途,例如应用于组织和/或皮下的填充剂。
37.本发明还提供一种填充剂,具体的为组织和/或皮下的填充剂,所述填充剂包括上述聚合物微球。
38.根据本发明的实施方案,所述填充剂还包括增效剂。
39.根据本发明的实施方案,所述填充剂中,增效剂位于所述聚合物微球的表面或周围。
40.根据本发明的实施方案,所述增效剂选自羧甲基纤维素钠、甘露醇、透明质酸钠、胶原、山梨糖醇、甘油、葡萄糖、氯化钠、生长因子中的至少一种,例如为两种或两种以上。
41.根据本发明的优选方案,所述填充剂中,所述聚合物微球和增效剂的质量比为1:(0~5),例如为1:0.0001,1:0.001,1:0.01,1:0.1,1:1,1:2,1:3,1:4,1:5。
42.本发明还提供上述聚合物微球和/或填充剂在制备用于组织修复和填充等生物医
学领域的材料中的应用。
43.本发明的技术方案具有下述有益效果:
44.低聚乳酸(ola)及其水解产物乳酸是存在于人体中的物质,因此对生物体和环境无害。本发明以低聚乳酸作为乳化剂制备微球,能够避免常规乳化剂的毒性问题,免去制备后期的洗涤除杂过程,简化微球制备工艺。
45.人工合成的低聚乳酸是通过乳酸之间的缩聚脱水得到,制备过程无须引入其它物质,因此得到的低聚乳酸的成分更加单一,没有杂质。作为应用于生物医用领域的产品,乳化剂杂质含量越少,聚合物微球制备体系越纯净,最终微球产品的杂质含量越少,产品的安全性越高。
46.此外,低聚乳酸与聚乳酸类可降解材料的化学结构极度相似,二者之间的相容性良好。本发明以低聚乳酸作为制备可降解聚合物微球的乳化剂,制备出的微球性能(如粒径、粒径分布、形貌等)更加可控,微球产率更高。并且低聚乳酸优异的抗菌性能,能够赋予微球产品抗菌、易保存的特性。
47.现有技术中,以聚乙烯醇或透明质酸钠等为乳化剂制备的微球被植入皮下或组织后,通常是起到“先填充再修复”的作用。本发明中,以低聚乳酸作为乳化剂制备的微球在体内植入初期就能够释放乳酸(由微球表面的低聚乳酸乳化剂降解产生),因此聚合物微球在植入皮下或组织后第一时间刺激胶原再生并促进组织修复,即“填充和修复同时进行”。
附图说明
48.图1为实施例4中制备的聚合物微球ola-10mg、ola-30mg和ola-60mg的扫描电镜照片。
49.图2为新生ⅲ型胶原纤维百分含量测试结果。
50.图3为实施例5中制备的微球plla-ola和plla-pva的扫描电镜照片。
51.图4为通过mtt法计算得到微球的细胞增殖结果。
52.图5为新生ⅲ型胶原纤维百分含量测试结果。
具体实施方式
53.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解,下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明,而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
54.除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过已知方法制备。
55.实施例1
56.制备聚合物微球:
57.将200mg聚左旋乳酸(plla,分子量为34000g/mol)溶解在2ml的二氯甲烷中得到聚合物溶液,室温下将该聚合物溶液倒入20ml浓度为15mg/ml的低聚乳酸(分子量522g/mol)的水溶液中,3000rpm下乳化2分钟后倒入100ml水中600rpm/min下继续搅拌5小时,待二氯甲烷挥发后得到plla微球,微球粒径范围为2μm~34μm,平均粒径为19.9
±
7.2μm。
58.实施例2
59.将200mg的己内酯-丙交酯共聚物(pcla,己内酯与丙交酯摩尔比为2:8,分子量为65000g/mol)溶于10ml的氯仿中得到聚合物溶液,然后将该聚合物溶液分散在100ml浓度为10mg/ml的低聚乳酸(分子量为306g/mol)的水溶液中,6000rpm/min下乳化15秒,得到初乳液。将该初乳液倒入膜乳化机中反复压过孔径为30μm的微孔膜得到均匀乳液,然后倒入800ml的浓度为1%的nacl水溶液中进行液滴固化,得到pcla微球,微球粒径范围为7μm~36μm,平均粒径为24
±
6μm。
60.实施例3
61.将100mg的聚己内酯(pcl,分子量为25000g/mol)溶解于5ml的丙酮乙醇混合溶剂中(丙酮和乙醇体积比为7:3)得到pcl溶液,将该pcl溶液滴入60ml浓度为40mg/ml的低聚乳酸(分子量为162g/mol)的水溶液中,以800r/min搅拌混合12h,待有机溶剂去除后得到pcl微球,微球粒径范围为0.3μm~1.8μm,平均粒径为1
±
0.4μm。
62.实施例4
63.本实施例研究乳化剂浓度对微球的影响
64.将250mg的乙交酯丙交酯共聚物(plga,丙交酯与乙交酯摩尔比为75:25,分子量为25000g/mol)溶解在25ml的二氯甲烷中得到聚合物溶液,室温下将该聚合物溶液移入100ml浓度为30mg/ml的低聚乳酸水溶液中,500rpm/min下搅拌2小时,待二氯甲烷挥发后得到plga微球(标记为ola-30mg),微球的扫描电镜照片如图1中(b)所示。按照上述制备条件,分别改变低聚乳酸水溶液浓度为10mg/ml和60mg/ml,得到不同的plga微球,分别标记为ola-10mg和ola-60mg(扫描电镜照片分别如图1中(a)和(c)所示)。
65.从扫描电镜照片结果对微球的粒径进行统计学分析(结果见表1),可以看到随着乳化剂浓度的增加,微球粒径逐渐降低且粒径分布变窄。然而当乳化剂浓度过低时,微球呈现不规则的球形;当乳化剂浓度过高时,微球中出现了明显的乳化剂杂质颗粒,影响了微球的品质。
66.已知当聚合物微球用于面部填充时,微球粒径、形状等都会影响其对组织的填充修复效果。当粒径过小或形状不规则时,植入皮下后容易被巨噬细胞立即吞噬,从而起不到填充修复作用;当粒径过大时,容易造成注射器堵塞,不利于微球的使用。因此乳化剂浓度过低或者过高,都不利于制备出性能良好的聚合物微球。
67.测试例1
68.推挤力测试:
69.将实施例4制备的三种微球,分别按照微球:甘露醇:羧甲纤维素钠:水重量比为5:3:2:125的比例配置,搅拌均匀后得到混悬液,分别标记为:混悬液ola-10mg、混悬液ola-30mg和混悬液ola-60mg。
70.推挤力测试:用注射器抽取1ml静置后的混悬液,加26g针头,采用电子万能试验机检测该混悬液的推挤力。测试结果列于表1中。
71.表1不同乳化剂浓度制备的微球粒径及微球混悬液推挤力测试
[0072][0073]
由表1结果可知,微球ola-10mg由于粒径过大且形状不规则发生了堵针;而微球ola-30mg和ola-60mg则可以被顺利推挤。
[0074]
测试例2
[0075]
验证微球作为皮肤填充剂在皮下植入后刺激皮肤产生胶原蛋白的作用,以实施例4制得的微球进行动物实验。具体实验方法为:
[0076]
待测材料:分别将实施例4中的ola-10mg、ola-30mg和ola-60mg按照微球:水重量比为1:2配成水悬浮液作为待测材料;
[0077]
实验动物:雄性小鼠,重量(23
±
4)g,共3组,每组15只;
[0078]
注射剂量:单点注射0.1ml。
[0079]
取样时间节点:注射结束后的第7天、14天和21天。
[0080]
检测方法:
[0081]
将上述3组小鼠分别注射待测材料微球ola-10mg、微球ola-30mg和微球ola-60mg的水悬浮液,其中,将注射上述待测材料的小鼠左侧颈部皮肤作为试验组,注射水的右侧颈部皮肤作为空白对照组。植入上述待测材料后的3周内每天观察植入部位的皮肤外观反应情况,有无红肿、凸起;触摸注射局部组织内有无结节或肉芽等组织增生现象(结果列于表2中)。
[0082]
表2植入部位的皮肤外观反应情况
[0083][0084]
进一步处死实验动物,切取观察的皮肤组织,组织固定后进行天狼星红染色,通过偏光显微镜对试验组和空白对照组的组织切片进行观察并拍照。将各取样时间点的显微镜照片经image j软件统计,计算新生胶原——ⅲ型胶原纤维的量占总胶原量的百分比,分析微球对小鼠皮肤中胶原蛋白合成的作用(结果见表3和图2)。
[0085]
表3新生ⅲ型胶原纤维占总胶原量的百分比
[0086][0087]
由表2可知,ola-10mg组和ola-60mg组植入小鼠颈部皮下后均有不良反应出现,而ola-30mg组没有。说明乳化剂含量过多或者过低时制备的微球,由于会有形状不规则、乳化剂过多等问题出现,因此容易导致不良反应出现。
[0088]
从表3和图2的新生ⅲ型胶原纤维百分含量结果可知:注射7天、14天和21天后,试验组新生ⅲ型胶原纤维含量明显多于空白对照组,其中ola-30mg组的ⅲ型胶原纤维含量增加的最多。说明微球制备时的乳化剂浓度会影响微球的使用效果。
[0089]
实施例5
[0090]
本实施例研究乳化剂种类对微球的影响
[0091]
分别采用低聚乳酸、透明质酸钠混合甘露醇、聚乙烯醇为乳化剂制备左旋聚乳酸微球,对比不同乳化剂对微球性能的影响。
[0092]
(1)以低聚乳酸为乳化剂制备的微球:取实施例1制备的微球,记为plla-ola。
[0093]
(2)制备以透明质酸钠混合甘露醇为乳化剂制备的微球(plla-ha):参照中国专利文献cn113230451a的实施例1中制备的微球。具体过程是:步骤一:将特性粘度为0.9m3/kg的透明质酸钠溶于水中(透明质酸钠与水的质量百分比为1%)。向该透明质酸钠水溶液中加入10.3g甘露醇,搅拌溶解得到第一混合液。步骤二:称取分子量为34000g/mol的聚左旋乳酸9g,溶于100ml的二氯甲烷中,配制成第二混合液。步骤三:将第二混合液快速加入第一混合液中,利用乳化机在转速为2000rpm/min的条件下乳化3min,得到水包油的乳液。步骤四:将乳液在30~50℃的条件下脱除溶剂和部分水分,得到微球混悬液,冻干得到左旋聚乳酸微球(记为plla-ha),粒径范围为2~34μm。
[0094]
(3)制备以聚乙烯醇为乳化剂制备的微球(plla-pva):具体过程是:将9g聚左旋乳酸(分子量为34000g/mol)溶于135ml二氯甲烷中,加入1800ml质量浓度为0.5%的聚乙烯醇水溶液中,乳化机转速3000rpm/min下乳化10分钟,除去二氯甲烷后得到左旋聚乳酸微球(记为plla-pva),微球的粒径范围2~34μm。
[0095]
测试例3
[0096]
将实施例5中采用不同乳化剂制备出的三种聚乳酸微球冷冻干燥,称重计算产率,取一部分微球样品通过场发射扫描电镜进行表征。微球plla-ola和plla-pva的照片结果见图3,微球plla-ha的照片结果见中国专利文献cn113230451a中的图1~4。通过nano measurer软件对上述三种微球的扫描电镜结果进行粒径的测量计算,最终的微球粒径及分布结果见表4。分别取100mg的上述三种微球中,各加入4毫升注射用水,轻轻摇晃或者搅拌得到分散均匀的混悬液,计算从水加入微球到得到均匀混合液的时间,即为复溶速度(见表4)。
[0097]
比较图3和中国专利文献cn113230451a中的图1~4的扫描电镜结果可以看到,与形状规则的plla-ola微球相比,plla-ha微球容易出现不规则形状,这是由于透明质酸钠甘露醇的乳化性能较差,在微球成型过程中不能完全稳定乳液所致。与分散均匀的plla-ola微球相比,以传统乳化剂pva制备的plla-pva微球容易发生明显的团聚,这是因为pva的亲水性比ola较差,因此干燥后的plla-pva微球由于静电现象容易互相吸附。因此,plla-ola微球比plla-ha和plla-pva微球将具有更好的使用效果。
[0098]
从表4的微球产率结果可以看到,以透明质酸钠和甘露醇为乳化剂时,聚乳酸微球的产率最低、粒径分布最宽;以低聚乳酸制备的微球产率仅略低于聚乙烯醇制备的微球,粒径分布窄。上述结果与三种乳化剂的乳化能力有关,在该微球制备体系中,聚乙烯醇的乳化效果最好,其次是低聚乳酸,最后是透明质酸钠和甘露醇。从表4的微球复溶速度可以看出:plla-ola和plla-ha的复溶速度比plla-pva快,这是由于低聚乳酸和透明质酸钠比聚乙烯醇更亲水所致。
[0099]
表4乳化剂种类对聚乳酸微球性能的影响
[0100][0101]
测试例4
[0102]
以实施例5中采用不同乳化剂制备出的聚乳酸微球作为三种样品,首先分别将20μl的上述三种微球样品加入到96孔板的一个孔中,每种微球样品设置5个平行样,然后每孔加入200μl细胞密度为1
×
104/ml的真皮成纤维细胞悬液。然后放入培养箱并在37℃下分别培养1、3、5和7天后将96孔板取出。通过mtt法计算得到微球的细胞增殖结果,具体见图4。
[0103]
从图4可见,随着培养时间的增加,细胞在三种微球样品表面生长良好,数量均逐渐增多。在培养的第1、3、5和7天,plla-ola微球表面的细胞数量一直明显高于plla-ha和plla-pva。
[0104]
以上实验结果表明,相比于plla-ha和plla-pva微球,plla-ola微球能够明显促进真皮成纤维细胞在微球表面的黏附和生长,说明plla-ola微球中的低聚乳酸在早期释放更有利于促进周围细胞和组织的生长。
[0105]
测试例5
[0106]
以实施例5中采用不同乳化剂制备的聚乳酸微球作为三种样品,验证微球作为皮肤填充剂在皮下植入后刺激皮肤产生胶原蛋白的作用。具体实验方法为:
[0107]
待测材料:分别将实施例5中的plla-ola微球、plla-ha微球、plla-pva微球按照微球与水重量比为1:2配成水悬浮液作为待测材料,分别记为plla-ola、plla-ha和plla-pva;
[0108]
实验动物:雄性小鼠,重量(23
±
4)g,分为3组,每组15只;
[0109]
注射剂量:单点注射0.1ml。
[0110]
取样时间节点:注射结束后的第7天、14天和21天。
[0111]
检测方法:
[0112]
将上述3组小鼠分别注射上述待测材料plla-ola、plla-ha和plla-pva,其中,将注射上述待测材料的小鼠左侧颈部皮肤作为试验组,注射水的右侧颈部皮肤作为空白对照组。植入后的3周内每天观察植入部位的皮肤外观反应情况,有无红肿、凸起;触摸注射局部组织内有无结节或肉芽等组织增生现象(结果列于表5中)。
[0113]
表5植入部位的皮肤外观反应情况
[0114][0115]
注射结束的一定时间后处死实验动物,切取观察的皮肤组织,组织固定后进行天狼星红染色,通过偏光显微镜对试验组和空白对照组的组织切片进行观察并拍照。将各取样时间点的显微镜照片经image j软件统计,计算新生胶原——ⅲ型胶原纤维的量占总胶原量的百分比,分析不同微球对小鼠皮肤中胶原蛋白合成的作用(结果见表6和图5)。
[0116]
表6新生ⅲ型胶原纤维占总胶原量的百分比
[0117][0118]
由表5可知,三种微球在植入小鼠颈部皮下后均无不良反应出现,说明它们均具有良好的生物相容性。
[0119]
从表6和图5的新生ⅲ型胶原纤维百分含量结果可知:注射7天、14天和21天后,试验组新生ⅲ型胶原纤维含量明显多于空白对照组,其中填充剂plla-ola组的ⅲ型胶原纤维含量增加的最多。说明相比于plla-ha和plla-pva两组微球,plla-ola微球中的低聚乳酸及其早期释放更利于促进胶原的再生,以及周围组织的生长和修复。
[0120]
实施例6
[0121]
将1.25ml浓度为100mg/ml的nh4hco3溶液加入4ml浓度为62.5mg/ml的消旋聚乳酸(pdlla,分子量为80000g/mol)的甲苯溶液中,乳化得到初乳液,迅速将所得初乳液倒入150ml浓度为1mg/ml的低聚乳酸(分子量为400g/mol)水溶液中,室温下机械搅拌,待甲苯完全挥发后最终得到具有多孔结构的pdlla多孔微球,平均粒径为195.2
±
16.7μm。
[0122]
由此可见,加入无机盐nh4hco3后可以制备得到具有多孔结构的pdlla多孔微球。
[0123]
实施例7
[0124]
将200mg聚左旋乳酸(plla,分子量为34000g/mol)和10mg胶原一起分散在2ml的二氯甲烷中得到聚合物溶液,室温下将该聚合物溶液倒入20ml浓度为15mg/ml的低聚乳酸(分子量522g/mol)的水溶液中,3000rpm下乳化2分钟后倒入100ml水中600rpm/min下继续搅拌5小时,待二氯甲烷挥发后得到plla-胶原复合微球,微球平均粒径为54.9
±
8μm。
[0125]
测试例6
[0126]
以实施例2制得的pcla微球、实施例6制得的pdlla多孔微球、实施例7制得的plla-胶原复合微球进行动物实验,验证三种微球作为皮肤填充剂在皮下植入后刺激皮肤产生胶原蛋白的作用,具体实验方法为:
[0127]
待测材料:将实施例2中的pcla微球、实施例6制得的多孔pdlla微球、实施例7制得的plla-胶原复合微球,按照微球:水重量比为1:2配成水悬浮液作为待测材料;
[0128]
实验动物:雄性小鼠,重量(23
±
4)g,分为3组,每组15只;
[0129]
注射剂量:单点注射0.1ml。
[0130]
取样时间节点:注射结束后的第7天、14天和21天。
[0131]
检测方法:
[0132]
将上述小鼠分别注射待测微球的水悬浮液,其中,将注射上述待测材料的小鼠左侧颈部皮肤作为试验组,注射水的右侧颈部皮肤作为空白对照组。植入上述待测材料后的3周内每天观察植入部位的皮肤外观反应情况,均没有发生红肿、凸起;触摸注射局部组织内也没有结节或肉芽等组织增生现象,说明三种微球均具有良好的生物相容性。
[0133]
进一步处死实验动物,切取观察的皮肤组织,组织固定后进行天狼星红染色,通过偏光显微镜对试验组和空白对照组的组织切片进行观察并拍照。将各取样时间点的显微镜照片经image j软件统计,计算新生胶原——ⅲ型胶原纤维的量占总胶原量的百分比,分析微球对小鼠皮肤中胶原蛋白合成的作用(结果见表7)。从表7的新生ⅲ型胶原纤维百分含量结果可知:注射7天、14天和21天后,待测微球组新生ⅲ型胶原纤维含量明显多于空白对照组。
[0134]
表7新生ⅲ型胶原纤维占总胶原量的百分比
[0135][0136]
由表7的结果可知,采用浓度为10mg/ml的低聚乳酸水溶液制备出的pcla微球在皮下植入后即可实现刺激皮肤产生胶原蛋白、以及促进周围组织的生长和修复的作用。
[0137]
由表7的结果可知,实施例6的pdlla多孔微球在皮下植入后也可以实现刺激皮肤产生胶原蛋白、以及促进周围组织的生长和修复的作用。
[0138]
由表7的结果可知,实施例7制备得到plla-胶原复合微球在皮下植入后也可以实
现刺激皮肤产生胶原蛋白、以及促进周围组织的生长和修复的作用。
[0139]
以上对本发明示例性的实施方式进行了说明。但是,本技术的保护范围不拘囿于上述实施方式。本领域技术人员在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
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