1.本发明属于有机合成领域，基于及具体涉及一种基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的吩噻方法荧光探针的合成及其应用。
背景技术：
2.化合物聚集诱导发射的嗪检现象在2001年首次被发现。具有聚集诱导发射现象的测过荧光分子在有机溶剂中显示出弱的荧光特性，在不良溶剂中由于聚集效应产生强的氧亚盐阴荧光应用荧光发射。因此大量的硝酸具有聚集诱导发射的荧光分子被开发出来用于克服聚集导致的荧光淬灭效应。目前为止，探针具有聚集诱导发射的合成荧光分子有用于荧光传感器，光电材料，基于及生物检测等方面的吩噻方法潜力。
3.过氧亚硝酸盐阴离子过量对人体有害，嗪检人体内的测过活性氧是由压力、紫外线、氧亚盐阴荧光应用大气污染、硝酸吸烟等原因生成的探针。活性氧过量会摧毁使肌肤保持弹性的胶原蛋白和弹性蛋白，从而导致皮肤老化松弛，出现色斑。据报道，一些炎症性疾病，如神经系统疾病、癌症、心血管等疾病的发生与活性氧含量异常有极大的相关性。目前，科学家已经开发出多种荧光探针并将其应用于活性氧检测，识别活性氧探针的设计方案主要有芳香族硝化，含硒有机化合物、硼酸酯化合物、羟基苯胺衍生物和花青染料的氧化等。对于过氧亚硝酸盐阴离子的荧光检测有很多方法，然而这些探针仍有很多缺点，如发射波长短，响应时间长，不稳定，选择性差，检测限高，生物组织相容性差等。这些问题极大地激发了我们开发新的可高灵敏度，响应速度快，高选择性，特异性检测过氧亚硝酸盐阴离子的荧光探针，以更好的适应在生物体内对过氧亚硝酸盐阴离子的检测。近红外发射的荧光(650-900nm)探针因其对生物细胞的光损伤小，组织穿透能力较强，自体荧光干扰较低等优点，在疾病治疗领域具有重要的应用前景。本实验设计合成一种以吩噻嗪为骨架具有aie效应及fret效应具有特异性识别过氧亚硝酸盐阴离子功能的新型近红外探针。
技术实现要素：
4.本发明的目的是为了克服现有技术缺陷，提供一种对生物细胞组织伤害性小，能特异性检测过氧亚硝酸盐阴离子的近红外荧光探针。该探针具有良好的选择性，较高的灵敏度，可用于待测溶液中过氧亚硝酸盐阴离子浓度的准确测定，具有很大的生物应用前景。
5.本发明还提供了上述基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的荧光探针的合成方法及其应用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的近红外荧光探针，该探针的结构如下：
[0008][0009]
上述近红外荧光探针的制备方法，其包括以下步骤：
[0010]
1)将吩噻嗪和溴乙烷在dmf中发生反应制备化合物2的步骤；
[0011][0012]
2)将化合物2和三氯氧磷在dmf中发生反应制备化合物3的步骤；
[0013][0014]
3)化合物3和nbs在乙酸和氯仿的混合溶液中发生反应制备化合物4的步骤；
[0015][0016]
4)化合物4和二氨基马来腈在乙醇中发生反应制备目标产物的步骤；
[0017][0018]
较佳的，步骤1)中，反应在ar气保护和碱性条件下进行，吩噻嗪和溴乙烷的摩尔比为5:6；反应温度为回流下，反应时间为8小时。
[0019]
较佳的，步骤2)中，反应在ar气保护下进行，反应温度为回流下，反应时间为8小时；化合物3和pocl3摩尔比为1:1。
[0020]
较佳的，步骤3)中，反应在ar气保护下进行，乙酸和氯仿的混合溶液中乙酸与氯仿的体积比为1:1，反应温度为回流下，反应时间为5小时，化合物3和nbs的摩尔比为1:2。
[0021]
较佳的，步骤4)中，反应在ar气保护下进行，反应温度为室温，反应时间为4小时，化合物4与二氨基马来腈的摩尔比为1:1.5。
[0022]
本发明还提供了上述近红外探针用于测定过氧亚硝酸盐阴离子浓度的应用。具体的，该探针用于生物和环境体系中过氧亚硝酸盐阴离子含量而进行荧光检测。检测时，激发波长是420nm。
[0023]
与现有技术相比，本技术提供一种新的以吩噻嗪为骨架具有aie效应及fret效应具有特异性识别过氧亚硝酸盐阴离子功能的新型荧光探针。通过与过氧亚硝酸盐阴离子进
行配位，改变荧光特性，产生on-off效应。使得荧光强度减弱，实现检测荧光强度既可测定过氧亚硝酸盐阴离子的浓度测定。近红外发射的荧光探针具有对生物细胞的光损伤小，组织穿透能力较强，自体荧光干扰较低等优点，故我们合成了近红外荧光探针，并通1h nmr,
13
c nmr和质谱表征分析。探针可以在thf:h2o＝5:5溶液中对过氧亚硝酸盐阴离子快速的响应。这个探针表现出对过氧亚硝酸盐阴离子快速，定量，专一性好，高灵敏度的响应。
附图说明
[0024]
图1为本发明基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的荧光探针核磁氢谱。
[0025]
图2为本发明基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的荧光探针核磁碳谱。
[0026]
图3为本发明基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的荧光探针质谱。
[0027]
图4为本发明基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的荧光探针420nm激发对不同阴离子响应的荧光发射光谱图。
[0028]
图5为本发明基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的荧光探针在420nm处激发，不同离子在614nm处对过氧亚硝酸盐阴离子检测的干扰比较。
[0029]
图6为本发明基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的荧光探针420nm处激发，过氧亚硝酸盐阴离子浓度的滴定曲线。
具体实施方式
[0030]
以下通过优选实施方案对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
[0031]
本发明中所使用的原料均为普通市售产品，或者通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中开发的方法获得。
[0032]
一种基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的新型近红外探针，其结构如下：
[0033][0034]
上述基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的新型荧光探针的制备方法，具体包括以下步骤：
[0035]
1)化合物2的制备：
[0036]
ar保护，3.99g的吩噻嗪和2.18g的溴乙烷溶于dmf 150ml，70℃加热回流，每隔20min向三口烧瓶内加naoh(1.00g)，分四次添加。在此温度下搅拌加热回流8h。用dcm分别萃取三次(3
×
100ml)，饱和食盐水洗涤3次，合并收集有机层，用无水na2so4干燥，过滤，在旋转蒸发仪上除去大部分dcm，干法上样，石油醚为洗脱剂，柱层析分离，得到白色固体物质2(4.09g，产率87.5％)。化合物2的图谱信息如下：
[0037]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ7.15(td,j＝7.8,1.5hz,2h),7.09(dd,j＝7.6,1.4hz,2h),6.96(d,j＝8.1hz,2h),6.92
–
6.85(m,2h),3.86(q,j＝6.9hz,2h),1.25(t,j＝6.9hz,3h).
13
c nmr(126mhz,dmso)δ144.56,127.73,127.15,123.14,122.49,115.60,41.16,12.92.
[0038]
合成路线如下：
[0039][0040]
2)化合物3的制备：
[0041]
室温下将3.41g的a1溶解在60mldmf中，18.6mlpocl3在0℃滴加到22mldmf中，ar保护，a1溶液体系置于冰水浴中，pocl
3-dmf逐滴加入到a1溶液体系中，在80℃下搅拌并加热回流7h，冷却至室温，向溶液中慢慢加入冰水混合物，然后用naoh水溶液调节ph至8，二氯甲烷萃取3次，饱和食盐水洗涤3次，柱层析分离，得到黄色固体物a2(3.28g，85％)。化合物3的图谱信息如下：
[0042]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.73(d,j＝2.6hz,1h),7.65(dt,j＝8.5,2.4hz,1h),7.51(t,j＝2.3hz,1h),7.23
–
7.12(m,1h),7.10
–
7.06(m,2h),7.04
–
6.99(m,1h),6.98
–
6.91(m,1h),3.92(dd,j＝7.0,2.6hz,2h),1.36
–
1.22(m,3h).
13
c nmr(126mhz,dmso)δ190.67,149.64,142.70,130.89,130.38,128.13,127.71,127.27,123.67,122.94,121.90,116.23,115.22,41.89,12.60.
[0043]
合成路线如下：
[0044][0045]
3)化合物5的制备：
[0046]
向单口烧瓶中依次加入2.57g的化合物3，2.31g的nbs，10ml乙酸，10ml三氯甲烷，搅拌至完全溶解，升温至70℃，加热回流4h，冷却至室温，用二氯甲烷萃取3次饱和食盐水洗涤3次，用无水na2so4干燥，过滤，在旋转蒸发仪上除去大部分溶剂，干法上样，石油醚和二氯甲烷为洗脱剂，柱层析分离，得橙黄色固体化合物4(2.49g，74.1％)。化合物4的谱图信息如下：
[0047]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.79(s,1h),7.73(dd,j＝8.4,2.0hz,1h),7.59(d,j＝1.9hz,1h),7.42
–
7.33(m,2h),7.17(d,j＝8.4hz,1h),7.04
–
6.96(m,1h),3.96(t,j＝7.0hz,1h),1.30(t,j＝6.9hz,3h).
[0048]
合成路线如下：
[0049][0050]
4)终产物的制备：
[0051]
依次加入上述步骤制备的1.34g的化合物4，0.45g二氨基马来腈，继续向单口烧瓶中加入30ml无水乙醇，2滴冰乙酸，加热回流6h，待反应液自然冷却到室温后，减压抽滤，无水乙醚洗涤滤饼少量多次洗涤滤饼，自然晾干，得到橙红色的目标产物m2(1.46g，86％)，化
合物6的谱图(见图1-图3)信息如下：
[0052]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.08(d,j＝2.4hz,1h),7.85(d,j＝24.6hz,3h),7.69(d,j＝8.4hz,1h),7.34
–
7.23(m,2h),7.00(d,j＝8.4hz,1h),6.92(d,j＝8.6hz,1h),3.89(d,j＝7.0hz,2h),1.24(t,j＝6.7hz,3h).
13
c nmr(126mhz,dmso)δ153.57,146.48,142.48,130.40,130.33,128.95,126.37,126.27,124.70,122.41,117.43,115.21,115.18,114.73,114.45,113.96,103.08,41.82,12.42.esi-ms:m/z＝425.13[m+h
+
].
[0053]
合成路线如下：
[0054][0055]
荧光检测应用试验
[0056]
下文中为描述简便，将本发明制备所得目标化合物“基于吩噻嗪检测过氧亚硝酸盐阴离子的新型荧光探针”统一简称为“探针cy-1”。
[0057]
1)检测用储备液的配制：
[0058]
a)在每次测试前，先称取4.24mg的荧光探针cy-1，使用10ml容量瓶和hplc级的thf将其配置成1
×
10-3
mol/l的母液。吸取1ml母液置于100ml容量瓶，使用磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph＝6.86)和hplc级的thf按一定比例将其稀释并且定容，最后得到1.0
×
10-5
mol/l的待测液。
[0059]
b离子检测液的配置
[0060]
选取clo-、s
2-、so
32-、s2o3
2-、hs-、
·
oh、o
2-·
、onoo-、h2o2等这些常见的离子的标准物质，并且称取一定量，使用去离子水将其配成1.0
×
10-2
mol/l的待用离子溶液。
[0061]
2)光谱测定操作步骤
[0062]
a.荧光探针cy-1的紫外吸收和荧光发射光谱的测定
[0063]
用移液枪吸取2ml荧光探针cy-1的待测液(1.0
×
10-5
mol/l)置于4ml比色皿中，通过查阅文献先预先设置吸收波长范围(200nm-800nm)。先做空白试验，扣除空白再进行紫外吸收光谱操作，得到我们的最大吸收波长。
[0064]
用移液枪吸取2ml荧光探针cy-1的待测液(1.0
×
10-5
mol/l)置于4ml比色皿中，通过查阅文献先预先设置激发波长得到一个发射光谱并且确定好适合的狭缝大小，再通过得到的发射波长反扫得到一个激发光谱，通过我们得到的激发光谱，选取需要的激发波长进行荧光发射波长的测定。
[0065]
b.荧光探针cy-1在不同离子下的荧光发射光谱的测定
[0066]
用移液枪吸取2ml荧光探针cy-1的待测液(1.0
×
10-5
mol/l)置于4ml比色皿中，再依次吸取20μl(10eq)的离子溶液(1.0
×
10-2
mol/l)，测定加入常见离子后(加入后先搅拌一分钟，再大约静置15min)的荧光发射光谱，然后根据离子光谱的变化找出我们所需要的响应离子。结果如图4所示。从图4中我们可以看出在420nm处激发，测定荧光发射光谱，只有onoo-的加入才会明显的导致614nm处荧光发射峰强度的明显降低。根据荧光发射光谱所反映的情况，我们得到荧光探针cy-1对于onoo-有比较好的响应。
[0067]
c.荧光探针cy-1的荧光光谱滴定实验
[0068]
先用移液枪吸取2ml探针溶液(1.0
×
10-5
mol/l)进行空白试验然后依次吸取一定当量onoo-加入到比色皿中。测试对应当量下紫外吸收光谱和荧光发射光谱，直到曲线不再变化，即停止测试。然后将不同当量下onoo-曲线进行叠加，得到荧光滴定谱图。结果如图6所示。图6是在420nm处激发获得的荧光滴定曲线。从图中可以看出随着过氧亚硝酸盐阴离子浓度的增大，614nm处的荧光发射强度逐渐减弱，524nm处的荧光发射强度逐渐增强。
[0069]
d.荧光探针cy-1的离子竞争实验
[0070]
用移液枪吸取2ml荧光探针cy-1待测液(1.0
×
10-5
mol/l)置于4ml比色皿中，然后再依次吸取20μl(10eq)离子溶液(1.0
×
10-2
mol/l)(clo-、s
2-、so
32-、s2o3
2-、hs-、
·
oh、o
2-·
、onoo-、h2o2)加入比色皿中，静置15min，之后测定荧光发射光谱。
[0071]
用移液枪再吸取20μl(10eq)离子onoo-溶液(1.0
×
10-2
mol/l)加入比色皿中搅拌一分钟，静置15min，之后测定荧光发射光谱。
[0072]
比较两者之间的荧光谱图的变化，来判断其它离子是否对于onoo-的检测有干扰作用。测量结果如图5所示，可以看出各种离子对过氧亚硝酸盐阴离子测试的干扰几乎可以忽略不计，说明本发明的荧光探针分子具有良好的特异识别性能，并且受到其他离子的干扰较小。
[0073]
e.荧光探针cy-1的检测极限实验
[0074]
将配好的待测液cy-1(1.0
×
10-5
mol/l)用移液枪吸取2ml，测试空白发射光谱(激发波长420nm，狭缝2nm)，得到荧光强度数据，然后计算这些数据的方差。在比色皿中滴加不同当量的onoo-，测试对应onoo-当量的发射光谱图。根据下式进行计算荧光探针cy-1对于onoo-的检测极限：
[0075]
lod(limit of detection)＝3σbi/m
[0076]
m表示响应离子浓度和荧光强度变化关系图中曲线的斜率，σbi表示空白实验数据的方差。检测限经过计算为1.2
×
10-3
mol/l。