一种检测隐球菌的种检针组制作引物探针组合、方法以及试剂盒
技术领域
1.本发明属于真菌病原学检测技术领域，测隐具体涉及一种检测隐球菌的球菌引物探针组合
、
方法以及试剂盒
。物探
背景技术：
2.隐球菌是种检针组制作一类危害人类健康的致病性真菌
。
不同隐球菌的测隐隐球菌在流行病学和临床致病过程中存在明显差异
。
其中，球菌格特隐球菌是物探一类感染免疫正常人群的致病性隐球菌
。
其中，种检针组制作
vgii
型隐球菌在加拿大温哥华曾引发隐球菌脑膜炎的测隐爆发流行，需要在临床上格外重视
。球菌
然而，物探格特隐球菌的种检针组制作感染通常为隐形感染，在临床早期不易察觉，测隐容易误诊
。球菌
故格特隐球菌的早期检测与分型对隐球菌病的治疗至关重要
。
3.现有的隐球菌检测方法如墨汁染色法
、
培养鉴定法等尽管能够检测隐球菌，但敏感度较低
、
耗时较长，且无法检测隐球菌的类型
。
由此，如何快速准确地检测格特隐球菌成为一项亟待解决的技术问题
。
技术实现要素：
4.本发明提供了一种检测隐球菌的引物探针组合
、
方法以及试剂盒以及该引物探针组合在检测隐球菌中的应用，通过针对隐球菌
、
新生隐球菌和
/
或格特隐球菌的特定基因片段设计对应的引物探针组合，能够准确地检测隐球菌，帮助提高隐球菌的检测效率以及准确性
。
5.第一方面，本技术提供一种隐球菌的引物探针组合，所述引物包括第一引物，所述第一引物包括第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物的核苷酸序列如
seq id no.1
所示，所述第一反向引物的核苷酸序列如
seq id no.2
所示；所述探针包括第一探针，所述第一探针的核苷酸序列如
seq id no.3
所示
。
6.在一些实施例中，所述第一引物用于识别所述隐球菌中如
seq id no.4
所示的核苷酸序列
。
7.在一些实施例中，所述第一探针的5’
端连接有第一荧光报告基团，所述第一探针的3’
端连接有第一荧光淬灭基团
。
8.在一些实施例中，所述引物包括第二引物，所述第二引物包括第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物的核苷酸序列如
seq id no.5
所示，所述第二反向引物的核苷酸序列如
seq id no.6
所示；所述探针包括第二探针，所述第二探针的核苷酸序列如
seq id no.7
所示
。
9.在一些实施例中，所述第二引物用于识别新生隐球菌中如
seq id no.8
所示的核苷酸序列
。
10.在一些实施例中，所述第二探针的5’
端连接有第二荧光报告基团，所述第二探针的3’
端连接有第二荧光淬灭基团
。
11.在一些实施例中，所述引物包括第三引物，所述第三引物包括第三正向引物和第
三反向引物，所述第三正向引物的核苷酸序列如
seq id no.9
所示，所述第三反向因素的核苷酸序列如
seq id no.10
所示；所述探针包括第三探针，所述第三探针的核苷酸序列如
seq id no.11
所示
。
12.在一些实施例中，所述第三引物用于识别格特隐球菌中如
seq id no.12
所示的核苷酸序列
。
13.在一些实施例中，所述第三探针的5’
端连接有第三荧光报告基团，所述第三探针的3’
端连接有第三荧光淬灭基团
。
14.第二方面，提供一种检测隐球菌的方法，所述方法包括：获取待测样本的模板
dna
；通过聚合酶链式反应
pcr
对所述模板
dna
进行扩增以获取扩增结果，其中所述
pcr
的反应物包括第一方面任一实施例中的引物探针组合了；根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述隐球菌的检测结果为阳性或阴性
。
15.在一些实施例中，所述隐球菌包括格特隐球菌
、
新生隐球菌以及野生隐球菌中的至少一个
。
16.应理解，野生隐球菌指的是除了格特隐球菌和新生隐球菌以外的其他类型的隐球菌
。
17.在一些实施例中，所述根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述隐球菌的检测结果为阳性或阴性包括：在所述扩增结果中所述第一荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
的情况下，判断所述待测样本中所述隐球菌的检测结果为阳性；或在所述扩增结果中所述第二荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
的情况下，判断所述待测样本中所述新生隐球菌的检测结果为阳性；或在所述扩增结果中所述第三荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
的情况下，判断所述待测样本中所述格特隐球菌的检测结果为阳性
。
18.第三方面，提供一种检测隐球菌的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面任一实施例中的引物探针组合
。
19.在一些实施例中，所述试剂盒还包括：缓冲液
、
模板
dna、dna
聚合酶和
/
或脱氧核苷酸三磷酸
dntp。
20.第四方面，提供一种如第一方面任一实施例中的引物探针组合在检测隐球菌中的应用
。
附图说明
21.图1是本技术实施例一种隐球菌的检测方法的示意性流程图
。
22.图2是本技术实施例隐球菌的特异性扩增曲线图
。
23.图3是本技术实施例新生隐球菌的特异性扩增曲线图
。
24.图4是本技术实施例格特隐球菌的特异性扩增曲线图
。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例对本技术的技术方案作进一步介绍
。
26.本技术所公开的“范围”以下限和上限的形式来限定，给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的，选定的下限和上限限定了特别范围的边界
。
这种方式进行限定
的范围可以是包括端值或不包括端值的，并且可以进行任意地组合，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围
。
例如，如果针对特定参数列出了
60-120
和
80-110
的范围，理解为
60-110
和
80-120
的范围也是预料到的
。
此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：
1-3、1-4、1-5、2-3、2-4
和
2-5。
在本技术中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数
。
例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示
。
另外，当表述某个参数为
≥2
的整数，则相当于公开了该参数为例如整数
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12
等
。
27.在本技术的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性
。
28.如果没有特别的说明，本技术所提到的“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式
。
例如，所述“包括”和“包含”可以表示还可以包括或包含没有列出的其他组分，也可以仅包括或包含列出的组分
。
29.如果没有特别的说明，在本技术中，术语“或”是包括性的
。
举例来说，短语“a
或
b”表示“a
，b，或a和b两者”。
更具体地，以下任一条件均满足条件“a
或
b”：a为真（或存在）并且b为假（或不存在）；a为假（或不存在）而b为真（或存在）；或a和b都为真（或存在）
。
30.如果没有特别的说明，本技术的所有实施方式以及可选实施方式可以相互组合形成新的技术方案
。
31.隐球菌是一种在自然界分布很广
、
能够侵犯人体中枢系统从而引起隐球菌病的真菌
。
近年来，国内外隐球菌感染引发的疾病呈明显上升趋势
。
隐球菌感染人体后，主要引起肺炎
、
脑膜炎
、
皮肤或脏器感染
。
不同种类的隐球菌在流行病学和临床致病过程中存在明显的差异
。
例如，新生隐球菌主要感染免疫抑制人群，而格特隐球菌主要感染免疫正常人群
。
并且不同种类的隐球菌的致病率与致死率也存在显著差异
。
32.在感染隐球菌后，若仅根据临床表现进行诊断，极易造成误诊，因此，隐球菌的病原学检测是诊断和治疗隐球菌引起的疾病的主要依据
。
例如，通过脑脊液墨汁染色可以初步观察隐球菌的形态，但该方法的敏感性较低
。
又例如，通过隐球菌抗原试剂可以快速检测隐球菌抗原，但该方法仅能进行隐球菌的检测而无法帮助区分隐球菌的类型
。
再例如，通过隐球菌培养进行检测也能够检测是否存在隐球菌，但同样无法检测隐球菌的种类
。
33.有鉴于此，本技术提供了一种检测隐球菌的引物探针组合，基于该引物探针组合的聚合酶链式反应
pcr
能够准确
、
快捷地进行隐球菌检测并帮助确认隐球菌的种类
。
34.首先本技术实施例提供一种检测隐球菌的引物探针组合
。
35.其中，该引物包括第一引物，第一引物包括第一正向引物和第一反向引物
。
第一正向引物的核苷酸序列如
seq id no.1
所示，第一反向引物的核苷酸序列如
seq id no.2
所示
。
36.该探针包括第一探针，第一探针的核苷酸序列如
seq id no.3
所示
。
37.具体来说，发明人通过生物信息学方法，通过对隐球菌
、
金色葡萄球菌
、
克氏肺炎菌
、
大肠杆菌
、
白色念珠菌等细菌的全部基因组进行比较，不局限于单一的编码基因，而是在整个基因组层面寻找差异位点，从而设计出了核苷酸序列如
seq id no.1
和
seq id no.2
所示的第一引物
。
利用第一引物对进行隐球菌检测能够高效
、
准确地检测所有类型的隐球
菌
。
38.应理解，本技术所述的隐球菌包括但不限于新生隐球菌
、
格特隐球菌
、
戈卢比隐球菌等
。
39.第一正向引物的核苷酸序列具体为：
gtgggagcaagttctctatcca。
40.第一反向引物的核苷酸序列具体为：
agtgttggaggtgaacgtgg。
41.第一引物用于识别隐球菌中如
seq id no.4
所示的核苷酸序列
。
换言之，针对所有隐球菌设计的第一引物能够特异性识别隐球菌中如
seq id no.4
所示的核苷酸序列
。
42.可选地，第一探针的5’
端连接有第一荧光报告基团，所述第一探针的3’
端连接有第一荧光淬灭基团
。
43.其中，第一荧光报告基团包括但不限于
6-羧基荧光素（
fam
）
、
四氯-6-羧基荧光素（
tet
）
、2
，
7-二甲基-4
，
5-二氯-6-羧基荧光素（
joe
）
、
六氯-6-甲基荧光素（
hex
）
、
花青素荧光染料
cy3、6-羧基-四甲基若丹明（
tamra
）
。
第一荧光淬灭基团包括但不限于
6-羧基-四甲基若丹明（
tamra
）
、4-(4-恶烷氨基苯偶氮
)
苯甲酸（
dabcyl
）或黑洞淬灭剂
bhq1、bhq2、bhq3。
44.例如，第一探针的5’
端连接有
fam
基团，第一探针的3’
端连接有
bhq1
基团
。
即第一探针为：
fam-tgtatcatccttgatatcgtcgcttacggt-bhq1。
45.可选地，该引物包括第二引物，第二引物包括第二正向引物和第二反向引物
。
其中第二正向引物的核苷酸序列如
seq id no.5
所示，第二反向引物的核苷酸序列如
seq id no.6
所示
。
该探针包括第二探针，第二探针的核苷酸序列如
seq id no.7
所示
。
46.第二引物用于识别新生隐球菌中如
seq id no.8
所示的核苷酸序列
。
47.具体来说，用于检测隐球菌的引物探针组合还可以包括第二引物和第二探针
。
其中，第二引物和第二探针针对新生隐球菌设计，能够特异性地识别新生隐球菌如
seq id no.8
所示的核苷酸序列，从而对新生隐球菌进行准确地检测
。
换言之，通过第二引物和探针不仅能够准确地检测隐球菌，并且能够确定检测到的隐球菌为新生隐球菌
。
在能够准确检测隐球菌的基础上，还能够确认隐球菌的类型
。
48.其中，第二正向引物的核苷酸序列具体为：
gtccatgcgcctccttatga。
49.第二反向引物的核苷酸序列具体为：
aagcgacaagaagctgggaa。
50.可选地，第二探针的5’
端连接有第二荧光报告基团，第二探针的3’
端连接有第二荧光淬灭基团
。
51.其中，第二荧光报告基团包括但不限于
6-羧基荧光素（
fam
）
、
四氯-6-羧基荧光素（
tet
）
、2
，
7-二甲基-4
，
5-二氯-6-羧基荧光素（
joe
）
、
六氯-6-甲基荧光素（
hex
）
、
花青素荧光染料
cy3、6-羧基-四甲基若丹明（
tamra
）
。
第二荧光淬灭基团包括但不限于
6-羧基-四甲基若丹明（
tamra
）
、4-(4-恶烷氨基苯偶氮
)
苯甲酸（
dabcyl
）或黑洞淬灭剂
bhq1、bhq2、bhq3。
52.例如，第二探针的5’
端连接有
fam
基团，第二探针的3’
端连接有
bhq1
基团
。
即第二探针为：
fam-actggaatgaaacagaaagaggag-bhq1。
53.可选地，该引物包括第三引物，第三引物包括第三正向引物和第三反向引物
。
其中，第三正向引物的核苷酸序列如
seq id no.9
所示，第三反向引物的核苷酸序列如
seq id no.10
所示
。
该第三探针包括第三探针，第三探针的核苷酸序列如
seq id no.11
所示
。
54.可选地，第三引物用于识别格特隐球菌中如
seq id no.12
所示的核苷酸序列
。
55.具体来说，用于检测隐球菌的引物探针组合还可以包括第三引物和第三探针
。
第三引物和第三探针针对格特隐球菌设计，第三引物能够特异性地识别格特隐球菌如
seq id no.12
所示的核苷酸序列
。
从而能够对格特隐球菌进行准确地检测
。
换言之，在引物探针组合包括第三引物和第三探针的情况下，不仅能够检测隐球菌，还能够确定检测到的隐球菌为格特隐球菌
。
由此，在精准检测隐球菌的同时还能够确认隐球菌的类型
。
56.其中，第三正向引物的核苷酸序列具体为：
agctatccgcaatcttcccg。
57.第三反向引物的核苷酸序列具体为：
gatttgtgaggccgtctgga。
58.可选地，第三探针的5’
端连接有第三荧光报告基团，第三探针的3’
端连接有第三荧光淬灭基团
。
59.其中，第三荧光报告基团包括但不限于
6-羧基荧光素（
fam
）
、
四氯-6-羧基荧光素（
tet
）
、2
，
7-二甲基-4
，
5-二氯-6-羧基荧光素（
joe
）
、
六氯-6-甲基荧光素（
hex
）
、
花青素荧光染料
cy3、6-羧基-四甲基若丹明（
tamra
）
。
第三荧光淬灭基团包括但不限于
6-羧基-四甲基若丹明（
tamra
）
、4-(4-恶烷氨基苯偶氮
)
苯甲酸（
dabcyl
）或黑洞淬灭剂
bhq1、bhq2、bhq3。
60.例如，第三探针的5’
端连接有
fam
基团，第二探针的3’
端连接有
bhq1
基团
。
即第三探针为：
fam-tcgcaagcgagcacgatggg-bhq1。
61.应理解，第一荧光报告基团
、
第二荧光报告基团和第三荧光报告基团可以相同也可以不同
。
第一荧光淬灭基团
、
第二荧光淬灭基团和第三荧光淬灭基团可以相同也可以不相同
。
62.本技术实施例提供的引物探针组合可以仅包括第一引物和第一探针
、
第二引物和第二探针或第三引物和第三探针，分别用于进行高效
、
准确地隐球菌
、
新生隐球菌或格特隐球菌检测；也可以包括第一引物
、
第二引物
、
第一探针和第二探针，用于进行隐球菌检测的同时确认隐球菌是否为新生隐球菌；还可以包括第一引物
、
第三引物
、
第一探针和第三探针，用于进行隐球菌检测的同时确认隐球菌是否为格特隐球菌；或者还可以包括第一引物
、
第二引物
、
第三引物
、
第一探针
、
第二探针和第三探针，用于进行隐球菌检测的同时确认隐球菌是否为新生隐球菌或格特隐球菌
。
63.上述引物探针组合在检测和鉴定隐球菌时具有敏感性高
、
特异性强的明显优势
。
进一步地，利用上述引物探针组合还能够在检测隐球菌的同时鉴定隐球菌的类型，帮助临床早期对隐球菌的快速诊断
。
64.本技术实施例还提供一种检测隐球菌的方法
100。
65.图1为本技术实施例检测隐球菌的方法
100
的示意性流程图
。
如图1所示，方法
100
包括：
s101
，获取待测样本的模板
dna。
66.s102
，通过聚合酶链式反应
pcr
对待测样本的模板
dna
进行扩增以获取扩增结果
。
其中，
pcr
的反应物包括本技术任一实施例中的引物探针组合
。
67.s103
，根据扩增结果判断待测样本中隐球菌的检测结果为阳性或阴性
。
68.具体来说，本技术提供的上述引物探针组合通过荧光定量
pcr
能够有效检测待测样本中是否存在隐球菌，进一步地，还能够帮助判断隐球菌的类型
。
69.可选地，方法
100
中的隐球菌包括格特隐球菌
、
新生隐球菌以及野生型隐球菌中的至少一个
。
其中，野生型隐球菌指的是除新生隐球菌和格特隐球菌以外的其他类型的隐球菌
。
70.可选地，待测样本包括血液
、
体液
、
和
/
或肺部组织
。
71.可选地，在
s102
中，
pcr
反应物包括第一引物和第一探针
。
在
s103
中，根据扩增结果判断待测样本中的隐球菌为阳性或阴性包括：在扩增结果中，第一荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
的情况下，判断待测样本中隐球菌的检测结果为阳性
。
72.在扩增结果中，第一荧光报告基团没有荧光对数增长或第一荧光报告基团有荧光对数增长但循环阈值
ct
大于
30.0
的情况下，判断待测样本中隐球菌的检测结果为阴性
。
73.可选地，在
s102
中，
pcr
反应物包括第二引物和第二探针
。
在
s103
中，根据扩增结果判断待测样本中的隐球菌为阳性或阴性包括：在扩增结果中，第二荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
的情况下，判断待测样本中新生隐球菌的检测结果为阳性
。
74.在扩增结果中，第二荧光报告基团没有荧光对数增长或第二荧光报告基团有荧光对数增长但循环阈值
ct
大于
30.0
的情况下，判断待测样本中新生隐球菌的检测结果为阴性
。
75.实际应用中，待测样本通常为未知样本
。
可以先通过第一引物和第一探针检测待测样本中是否存在隐球菌，在存在隐球菌的情况下，再通过第二引物和第二探针
、
第三引物和第三探针检测待测样本中隐球菌的类型
。
也可以同时通过上述多个引物和多个探针对待测样本进行检测，通过各个引物探针的检测结果结合分析确定待测样本中是否存在隐球菌并判断隐球菌的类型
。
76.示例性地，同时通过第一引物
、
第二引物
、
第一探针和第二探针对待测样本进行检测
。
若第一荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
，则待测样本中隐球菌为阳性；若第二荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
，则待测样本中的隐球菌为新生隐球菌
。
若第二荧光报告基团没有荧光对数增长或有荧光对数增长且循环阈值
ct
大于
30.0
，则待测样本中的隐球菌不是新生隐球菌，可能是格特隐球菌或野生型隐球菌
。
77.可选地，在
s102
中，
pcr
反应物包括第三引物和第三探针
。
在
s103
中，根据扩增结果判断待测样本中的隐球菌为阳性或阴性包括：在扩增结果中，第三荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
的情况下，判断待测样本中格特隐球菌的检测结果为阳性
。
78.在扩增结果中，第三荧光报告基团没有荧光对数增长或第三荧光报告基团有荧光
对数增长但循环阈值
ct
大于
30.0
的情况下，判断待测样本中格特隐球菌的检测结果为阴性
。
79.可选地，在
s102
中，
pcr
反应物包括第一引物
、
第二引物
、
第一探针和第二探针
。
在
s103
中，根据扩增结果判断待测样本中的隐球菌为阳性或阴性包括：在扩增结果中，第一荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
的情况下，判断待测样本中隐球菌的检测结果为阳性
。
80.在扩增结果中，第一荧光报告基团无对数增长，或有对数增长但且循环阈值
ct
大于
30.0
的情况下，判断待测样本中隐球菌的检测结果为阴性
。
81.在扩增结果中，第二荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
的情况下，判断待测样本中的隐球菌中存在新生隐球菌
。
82.其他情况下，判断待测样本中的隐球菌不存在新生隐球菌
。
换言之，待测样本中的隐球菌可能为格特隐球菌或野生型隐球菌
。
83.可选地，在
s102
中，
pcr
反应物包括第一引物
、
第二引物
、
第三引物
、
第一探针
、
第二探针以及第三探针
。
在
s103
中，根据扩增结果判断待测样本中的隐球菌为阳性或阴性包括：在扩增结果中，第一荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
的情况下，判断待测样本中隐球菌的检测结果为阳性
。
84.在扩增结果中，第一荧光报告基团无对数增长，或有对数增长但且循环阈值
ct
大于
30.0
的情况下，判断待测样本中隐球菌的检测结果为阴性
。
85.在扩增结果中，第二荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
的情况下，判断待测样本中的隐球菌存在新生隐球菌
。
86.在扩增结果中，第三荧光报告基团有荧光对数增长且循环阈值
ct
小于或等于
30.0
的情况下，判断待测样本中的隐球菌存在格特隐球菌
。
87.其他情况下，判断待测样本中的隐球菌为野生型隐球菌
。
88.应理解，在第一荧光报告基团
、
第二荧光报告基团和
/
或第三荧光报告基团为相同的基团时，荧光定量
pcr
可以通过荧光对数增长的具体数量确定第一荧光报告基团
、
第二荧光报告基团和
/
或第三荧光报告基团是否有相应的对数增长
。
89.本技术实施例还提供一种检测隐球菌的试剂盒，该试剂盒包括本技术任一实施例中的引物探针组合
。
90.可选地，该试剂盒还包括：缓冲液
、
模板
dna、dna
聚合酶和
/
或脱氧核苷酸三磷酸
dntp。
91.可选地，该试剂盒还包括
mgcl2。
92.使用本技术实施例提供的试剂盒，能够准确
、
快速地检测隐球菌并进一步帮助判断隐球菌的种类
。
操作简单
、
检测时间短
、
适应性强的同时还能进一步鉴别致病菌的种类，从而进行快速准确的临床诊断，为疾病治疗赢得宝贵的时间
。
93.另外，本技术实施例还提供一种如上述任一实施例中的引物探针组合在检测隐球菌中的应用
。
94.接下来，对本技术提供的检测方法
100
的具体步骤做进一步介绍
。
应理解，下述实施例仅为了说明本技术的鉴定方法的实施方式，其中具体试剂用量或仪器的使用可根据需要调整，不构成对本技术实施例的限定
。
95.实施例1：模板
dna
的提取一
、
试验材料：待测样本本技术所述的待测样本包括但不限于血液
、
体液或肺部组织
。
96.二
、
主要试剂与仪器
dna
提取采用天根公司酵母基因提取试剂盒；引物和探针的合成由生物工程有限公司完成；
dna
聚合酶购自
takara
公司；荧光定量
pcr
仪购于
roche
公司
。
97.三
、
实验方法按照
dna
提取试剂盒说明书提取
dna
，使用分光光度计，测定样品中
dna
含量，测定
od260/od280
比值
。
本实施例中提供的待测样本中含有新生隐球菌
、
格特隐球菌
、
大肠杆菌
、
金黄色葡萄球菌
、
肺炎脓杆菌和肺炎克雷伯菌
。
98.实施例2：
pcr
扩增反应
2.1 隐球菌的
pcr
检测一
、
试验材料模板
dna。
具体的
pcr
反应体系详见表
1。
99.二
、
主要试剂与仪器表1：实时荧光
pcr
反应体系
1 (25 μ
l)
100.三
、
实验方法本实施例采用
takara
公司的
prime star 2x mix
的
pcr
扩增试剂盒进行
pcr
扩增反应，
pcr
扩增过程可参见该试剂盒的产品使用说明书
。
101.本实施例中，反应体系1中第一正向引物的核苷酸序列如
seq id no.1
所示，第一反向引物的核苷酸序列如
seq id no.2
所示，第一探针的核苷酸序列如
seq id no.3
所示
。
102.本实施例中，
pcr
反应的扩增条件为：
95
oc预变性
5min
；
95oc 10s
，
68oc 60s
，
45
个循环，获得扩增结果
。
103.四
、
分析判断扩增结果图2为本技术实施例通过上述操作得到的隐球菌的扩增曲线
。
图2的扩增曲线中，纵坐标为相对荧光单位
(relative fluorescence unit, rfu)
，横坐标为扩增的循环数目
(cycle)。
104.如图2所示，在对待测样本的检测结果中，新生隐球菌和格特隐球菌均被特异性扩增，换言之，样品中的所有隐球菌被特异性扩增，具有相应的扩增曲线，
fam
荧光有荧光对数增长，且
ct≤30.0。
而平行实验的金黄色葡萄球菌
、
肺炎脓杆菌
、
大肠杆菌
、
肺炎克雷伯菌均
无特异性扩增曲线
。
说明第一引物和第一探针具有良好的特异性，能够准确识别待测样本中的隐球菌
。
并且，新生隐球菌的3条扩增曲线
、
格特隐球菌的3条扩增曲线均具有几乎一致的荧光对数增长，说明通过第一引物和第一探针检测隐球菌的方法具有良好的重复性
。
另外，图2中的模板
dna
浓度为
0.1 ng/
μ
l
，经过荧光
pcr
仍能有良好的荧光对数响应，说明通过第一引物和第一探针检测隐球菌的方法具有优异的敏感性
。
105.由此，本技术提供的引物探针组合能够准确
、
高效地进行隐球菌检测
。
106.2.2 新生隐球菌的
pcr
检测一
、
试验材料：模板
dna。
具体的
pcr
反应体系详见表
2。
107.二
、
主要试剂与仪器表2：实时荧光
pcr
反应体系
2 (25 μ
l)
108.三
、
实验方法本实施例采用
takara
公司的
prime star 2x mix
的
pcr
扩增试剂盒进行
pcr
扩增反应，
pcr
扩增过程可参见该试剂盒的产品使用说明书
。
109.本实施例中，反应体系2中第二正向引物的核苷酸序列如
seq id no.5
所示，第二反向引物的核苷酸序列如
seq id no.6
所示，第二探针的核苷酸序列如
seq id no.7。
110.本实施例中，
pcr
反应的扩增条件为：
95
oc预变性
5min
；
95oc 10s
，
68oc 60s
，
45
个循环，获得扩增结果
。
111.四
、
分析判断扩增结果图3为本技术实施例通过上述操作得到的新生隐球菌的扩增曲线
。
图3的扩增曲线中，纵坐标为相对荧光单位
(relative fluorescence unit, rfu)
，横坐标为扩增的循环数目
(cycle)。
112.如图3所示，在对待测样本的检测结果中，新生隐球菌被特异性扩增，具有相应的扩增曲线，
fam
荧光有荧光对数增长，且
ct≤30.0。
而平行实验的格特隐球菌
、
金黄色葡萄球菌
、
肺炎脓杆菌
、
大肠杆菌
、
肺炎克雷伯菌均无特异性扩增曲线
。
说明第二引物和第二探针能够特异性识别待测样本中的新生隐球菌，具有良好的特异性
。
并且新生隐球菌的3条扩增曲线均具有几乎一致的荧光对数增长，说明通过第二引物和第二探针检测新生隐球菌的方法具有良好的重复性
。
另外，图3中的模板
dna0.1 ng/
μ
l
，经过荧光
pcr
仍能有良好的荧光对数响应，说明通过第二引物和第二探针检测新生隐球菌的方法具有优异的敏感性
。
113.由此，本技术提供的引物探针组合能够准确检测隐球菌的同时还能够确定隐球菌是新生隐球菌
。
114.2.3 格特隐球菌的检测一
、
试验材料：模板
dna。
具体的
pcr
反应体系详见表
3。
115.二
、
主要试剂与仪器表3：实时荧光
pcr
反应体系
3 (25 μ
l)
116.三
、
实验方法本实施例采用
takara
公司的
prime star 2x mix
的
pcr
扩增试剂盒进行
pcr
扩增反应，
pcr
扩增过程可参见该试剂盒的产品使用说明书
。
117.本实施例中，反应体系3中的第三正向引物的核苷酸序列如
seq id no.9
所示，第三反向引物的核苷酸序列如
seq id no.10
所示，第三探针的核苷酸序列如
seq id no.11
所示
。
118.本实施例中，
pcr
反应的扩增条件为：
95
oc预变性
5min
；
95oc 10s
，
68oc 60s
，
45
个循环，获得扩增结果
。
119.四
、
分析判断扩增结果图4为本技术实施例通过上述操作得到的格特隐球菌的扩增曲线
。
图4的扩增曲线中，纵坐标为相对荧光单位
(relative fluorescence unit, rfu)
，横坐标为扩增的循环数目
(cycle)。
120.如图4所示，在对待测样本的检测结果中，格特隐球菌被特异性扩增，具有相应的扩增曲线，
fam
荧光有荧光对数增长，且
ct≤30.0。
而平行实验的新生隐球菌
、
金黄色葡萄球菌
、
肺炎脓杆菌
、
大肠杆菌
、
肺炎克雷伯菌均无特异性扩增曲线
。
说明第三引物和第三探针能够特异性识别待测样本中的格特隐球菌，具有良好的特异性
。
并且格特隐球菌的3条扩增曲线均具有几乎一致的荧光对数增长，说明通过第三引物和第三探针检测格特隐球菌的方法具有良好的重复性
。
另外，图4中的模板
dna
浓度为
0.1 ng/
μ
l
，经过荧光
pcr
仍能有良好的荧光对数响应，说明通过第三引物和第三探针检测格特隐球菌的方法具有优异的敏感性
。
121.由此，本技术提供的引物探针组合能够准确检测隐球菌的同时还能够确定隐球菌是格特隐球菌
。
122.经过上述对隐球菌
、
新生隐球菌以及格特隐球菌的检测可以看出，本技术提供的引物探针组合能够对隐球菌
、
新生隐球菌以及格特隐球菌进行特异性鉴定，平行实验的金黄色葡萄球菌
、
肺炎脓杆菌
、
大肠杆菌
、
肺炎克雷伯菌结果均为阴性，没有特异性扩增曲线，由此，该引物探针组合具有良好的特异性能够准确对隐球菌
、
新生隐球菌以及格特隐球菌进行检测
。
另外，通过本技术提供的引物探针组合进行隐球菌检测时，不仅能够检测是否存
在隐球菌，还能够判断隐球菌是否为格特隐球菌或新生隐球菌，有利于在临床上帮助区分两种隐球菌造成的感染
。
通过本技术提供的检测试剂盒对隐球菌进行检测，操作简单且结果可靠准确看，能够帮助医师对隐球菌感染的疾病进行快速地诊断，有利于制定合适的治疗方法，减少药物滥用
。
123.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一种实现方式”、“一些实施例”、“示意性实施方式”、“示例”、“具体示例”、
或“一些示例”等的描述意指结合实施方式或示例描述的具体特征
、
结构
、
材料或者特点包含于本技术的至少一个实施方式或示例中
。
在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例
。
而且，描述的具体特征
、
结构
、
材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合
。
124.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本技术的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本技术进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本技术各实施例技术方案的范围
。