1.本发明属于培养基领域，种培具体涉及一种培养假单胞菌的养假盐培养基应用无机盐培养基及其应用。
背景技术：
2.吩嗪类化合物是单胞自然界中一大类抗菌、抑肿瘤的菌的及活性物质，具有广谱的无机抗菌、抑菌活性，种培主要由假单胞菌、养假盐培养基应用链霉菌及一些微生物分泌产生，单胞由于取代基取代了杂环上的菌的及位置不同而显现不同的颜色，也决定了不同化合物在理化性质和生物活性上的无机差异。
3.在最新研报中指出，种培培养基在生物制药成本中占比30％，养假盐培养基应用对生物药成本的单胞影响显著。现已有的菌的及用于合成吩嗪类化合物的培养基均为富营养培养基，里面含有价格较高的无机原料成分，例如酵母粉、胰蛋白胨等等。无机盐培养基的成本较低，其中仅含有微生物生长必须的无机盐离子和碳源，故又称基本培养基。若将无机盐培养基应用于吩嗪工业生产中必能大大降低原料成本，具有很大的工业应用价值。
技术实现要素：
4.本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种培养假单胞菌的无机盐培养基及其应用。
5.本发明的目的可以通过以下方案来实现：
6.本发明提供了一种培养假单胞菌的无机盐培养基，包括如下组分：
7.8-10g/l(nh4)2hpo4，5-7g/l k2hpo4，3-4g/l kh2po4，0.1-0.5g/l mgso4，4-6mg/lfecl3·
6h2o。
8.作为本发明的一个实施方式，所述假单胞菌包括橘黄色绿针假单胞菌lx24(pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca lx24)、致金色绿针假单胞菌gp72(pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens gp72)以及绿针假单胞菌ht66(pseudomonas chlororaphis subsp.chlororaphis ht66)中的一种。
9.本发明还提供了一种所述无机盐培养基在假单胞菌发酵合成多种吩嗪类化合物中的应用。
10.作为本发明的一个实施方式，所述假单胞菌发酵在合成多种吩嗪类化合物时，碳源为甘油，在培养基中的含量为18-22g/l，优选为20g/l。
11.作为本发明的一个实施方式，吩嗪类化合物的生物合成包括但不限于pca、2-oh-phz、pcn；具体为绿针假单胞菌gp72合成pca，绿针假单胞菌lx24合成2-oh-phz，绿针假单胞菌ht66合成pcn。
12.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
13.(1)本发明在无机盐培养基常规成分的基础上优化了碳源和氮源的比例，简化了微量元素的种类，使得多种绿针假单胞菌亚种的吩嗪类化合物的产量得到了大幅度的提升。优化后的培养gdm基较优化前提高了四倍；较传统的绿针假单胞菌kb培养基提高了33.08％。
14.(2)本发明针对绿针假单胞菌培养基价格较高的现状，使用无机盐培养基进行发酵培养可以显著降低未来工业发酵合成的原料成本。为今后pca工业合成改进提供方法指导，具有很大的工业应用价值。同时无机盐培养基成分明确且单一，也为未来吩嗪类化合物的代谢调控研究提供清晰的研究背景条件。
附图说明
15.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
16.图1为gp72在kb和gdm不同培养基中的生长情况曲线图；
17.图2为gp72在kb和gdm培养基中的产物合成情况曲线图；
18.图3为gp72在me和gdm培养基中的产物合成情况柱状图；
19.图4为gp72在铵根浓度梯度培养基中的发酵情况柱状图，其中a为不同铵根浓度下pca的产量，b为不同铵根浓度下发酵液的od
600
值；
20.图5为gp72在不同铁离子价态下的pca合成情况柱状图。
具体实施方式
21.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。
22.实施例1
23.本实施例提供了一种培养假单胞菌的无机盐培养基，该无机盐培养基的配方如下：9.9g/l(nh4)2hpo4,5.8g/l k2hpo4，3.7g/l kh2po4，0.12g/l mgso4，5.4mg/lfecl3·
6h2o。培养基的配制和菌株的培养步骤如下：
24.(1)无机盐培养基gdm的配制
25.在950ml蒸馏水的量筒中加入对应质量的(nh4)2hpo4，kh2po4，kh2po4，mgso4fecl3·
6h2o以及20g glycerol(本实验以甘油为碳源)，充分混匀至完全溶解，再用蒸馏水定容至1l，分装后121℃高温高压灭菌20分钟。
26.(2)实验所用菌株的发酵流程
27.将-80℃保存的菌株gp72(何延静,刘海明,胡洪波等.一株拮抗辣椒疫霉的假单胞菌的分离与鉴定[j].微生物学报,2006(04):516-521.)取出于lb固体培养基(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 10g/l以及20％琼脂)中划线活化两次，挑取平板上的一个单菌落在5ml lb(含amp100 mg/l)液体培养基中培养过夜。按照1％接种量，接种于含60ml灭菌后的无机盐培养基的250ml凹角发酵瓶中进行发酵。发酵实验均设置三个平行。
[0028]
(3)菌株生长检测
[0029]
本实验的菌株生长量采用od
600
进行表征，具体操作步骤如下：本实验共取样四次，分别为24h、48h、72h以及96h。在超净台中取生长到目标检测点的菌液1ml，12,000rpm离心1min后弃废液，用1ml蒸馏水重悬。为了使得检测值在0.2～0.8之间，再用蒸馏水稀释至合适浓度，使用分光光度计在λ＝600nm波长下检测菌体生物量。
[0030]
(4)吩嗪类化合物产量检测
[0031]
本实验的产物检测方法为高效液相色谱法，具体操作步骤如下：在超净台中取目标时间点的菌液400μl，加入6mol/l盐酸20μl进行酸化，静置20s。加入乙酸乙酯3.6ml后充分振荡混匀5min萃取。6,000rpm离心5min后取400μl上层清液于通风橱中过夜吹干。加入1ml hplc级乙腈溶解后用0.22μm滤头过滤至hplc样品瓶中，放于4℃冰箱中保存。
[0032]
以菌株gp72合成的次级代谢产物为pca为例，具体色谱操作参数如下。本实验所用的色谱柱为反向c18柱(agilent technologies,5μm,4.6*250mm)，流动相a相为0.1％甲酸水(1ml甲酸溶液溶于999ml超ⅰ水中)和b相为hplc级乙腈溶液。检测方法如下：洗脱速率1.0ml/分钟，将洗脱条件设置为0-2min，a：b＝80％：20％；2-15min，a：b＝50％：50％；15-20min，a：b＝20％：80％。紫外监测波长为254n，pca输出峰时间约为10.2分钟。利用来自上海农乐公司的pca标准品来制作测定吩嗪化合物的标准曲线，样品浓度与hplc检测的峰面积成正比。
[0033]
(5)实施过程和功效验证
[0034]
本研究的操作结果：
[0035]
gp72菌株生长对比
[0036]
以kb培养基(胰蛋白胨20g/l、甘油18g/l、mgso
4 0.732g/l、k2hpo
4 0.5142g/l)为对照，步骤与gdm相同，绘制gp72的生长曲线图如图1所示。从生物量的角度来看，菌株在kb培养基中的生物生长更具优势，48小时的od
600
值为gdm的两倍。
[0037]
pca产量对比
[0038]
以及kb培养基为对照，绘制gp72的pca产量曲线图如图2所示。该菌株gp72在gdm的pca产量可以达到1.07g/l，较传统的富营养kb培养基提高了33.08％，提高了吩嗪类化合物的产量。
[0039]
实施例2
[0040]
本实施例提供了一种培养假单胞菌的无机盐培养基，该无机盐培养基的配方如下：9.9g/l(nh4)2hpo4，5.8g/l k2hpo4，3.7g/l kh2po4，0.12g/l mgso4，20μmfecl3·
6h2o，培养基的配制和菌株的培养步骤如下：
[0041]
(1)无机盐培养基gdm的配制
[0042]
在950ml蒸馏水的量筒中加入9.9g(nh4)2hpo4，5.8g kh2po4，3.7g kh2po4，0.12gmgso4，20μm fecl3·
6h2o，20g glycerol(本实验以甘油为碳源)，充分混匀至完全溶解，再用蒸馏水定容至1l，分装后121℃高温高压灭菌20分钟。
[0043]
实验步骤与实施例1相同。
[0044]
对比例1
[0045]
本对比例的培养基是在clinton fuller 1988年改良版的e*medium，该培养基成分为1.1g/l(nh4)2hpo4，5.8g/l k2hpo4，3.7g/l kh2po4，12g/l mgso4，1ml microelement solution，实验步骤与实施例1相同。在该无机盐培养基中，假单胞菌合成吩嗪类化合物的产量较低，本发明的优势就在于可以显著提升假单胞菌的吩嗪类化合物产量。如图3所示，gp72在e*medium培养基中的pca产量仅有251.9mg/l，而在本发明的gdm培养基中的产量为1.07g/l，产量提高了近四倍。
[0046]
对比例2
[0047]
本对比例提供了一种培养假单胞菌的无机盐培养基，该无机盐培养基的配方、实验方法与实施例1基本相同，区别在于：将(nh4)2hpo4的浓度配置为10mm、20mm、30mm、50mm、80mm、100mm、120mm、150mm、180mm、200mm。
[0048]
结果如图4所示，pca产量是随铵根浓度增加而升高的，培养基中的铵根浓度很低10mm时，pca产量只有42mg/l，铵根浓度增加，pca产量也逐渐增加。当铵根浓度提高到150mm以上之后，铵根浓度增加，pca产量也不再增加。故gdm培养基中，(nh4)2hpo4为8-10g/l是吩嗪类化合物合成的最适浓度。
[0049]
对比例3
[0050]
本对比例提供了一种培养假单胞菌的无机盐培养基，该无机盐培养基的配方、实验方法与实施例1基本相同，区别在于：将fecl3·
6h2o替换为feso4·
7h2o。
[0051]
结果如图5所示，fecl3·
6h2o更有利于吩嗪类化合物的合成。
[0052]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。